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David Stevens:
Steuerung von Neurotransmitter- und Hormonfreisetzung

Forschung

Neurotransmitter werden als Antwort auf einen Stimulus unter streng kontrollierten Bedingungen freigesetzt. Die Freisetzung durch Exozytose wird durch einen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration hervorgerufen. Transmittergefüllte Vesikel verschmelzen mit der Zellmembran und setzen ihre Inhalte frei. Die Fusion wird durch SNARE-Komplexe, bestehend aus SNAP-25, Syntaxin und Synaptobrevin, kontrolliert (Jahn und Fasshauer, 2012). Diese Komplexe erzeugen die notwendige Energie für die Vesikelfusion mit der Plasmamembran. Die Bildung und Funktion der SNARE-Komplexe wird durch eine Vielzahl von Proteinen kontrolliert, die für die Feinabstimmung der Ausschüttung verantwortlich sind.

Von besonderer Bedeutung sind die Proteine der Munc18-Familie, die durch die Bildung des Vesikel-Akzeptorkomplexes das „Docking“ der Vesikel an die Plasmamembran ermöglichen, die Synaptotagmine, die im Innern des SNARE-Komplexes liegen und auf schnelle Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration antworten und die Primingfaktoren Munc13 und CAPS, die gebraucht werden, um den SNARE-Komplex fusionskompetent zu machen. Einmal geprimt, benötigen die Vesikel dann einen ausreichenden Kalziumstimulus zur Induktion der Fusion.

Wir sind hauptsächlich an der Funktion der Primingfaktoren Munc13 und CAPS interessiert. Wir verwenden Chromaffinzellen der Maus aus Primärkulturen (Abb. 1E) als Modellzelle für die Kalzium-stimulierte Exozytose. Wir verwenden elektrophysiologische Methoden, insbesondere Kapazitätsmessungen, um die Exozytose zu analysieren und Kohlefaseramperometrie, um die Katecholaminfreisetzung zu detektieren und die Menge und die Releaserate der Katecholaminfreisetzung dieser Zellen zu bestimmen. Zusätzlich verwenden wir hochauflösende bildgebende Verfahren, Elektronenmikroskopie sowie biochemische und molekularbiologische Methoden, um den Primingprozess zu untersuchen.

Wir haben Struktur- und Funktionsstudien an Munc13-1 (Stevens et al., 2005) durchgeführt sowie die Funktion von CAPS in der Exozytose (Liu et al., 2008; Speidel et al., 2005) untersucht. Beide Moleküle sind in der Lage die Katecholaminfreisetzung zu fördern und führen zu einem Anstieg des Vesikel-Priming. Die Domänenstruktur von CAPS1 und Munc13-1 ist in der Abbildung aus unserem Review Artikel über CAPS (Stevens and Rettig, 2009) dargestellt. Aktuell vertiefen wir diese Studien.

Abbildung 1: Die Funktion von CAPS bei der Exozytose 

A. Domänenstruktur von CAPS und des Primingfaktors Munc13-1. CAPS besitzt eine N-terminale dynactin-1-bindende Domäne (DBD). Der zentrale Bereich von CAPS enthält zwei Lipid-bindende Domänen, die C2-Domäne mit unklarer Funktion und die PH-Domäne, die für die Interaktion mit PIP2-reichen Regionen an der Innenseite der Plasmamembran notwendig ist. Daneben befindet sich die Munc13-homologe Domäne einschließlich der Syntaxin-Interaktions-domäne (SID) für das Priming der synaptischen Vesikel (SV) und eine C-terminale Domäne, die für die Bindung mit dense core Vesikeln (DCV) benötigt wird. CAPS besitzt eine MHD Domäne, die in Munc13 für das Priming (MUN Domäne) zuständig ist.

Chromaffinzelle

B, C. Aktuelle Modelle postulieren, dass geprimte Vesikel in zwei Zuständen existieren, ein „slowly releasable“ und ein „rapidly releasable“ Zustand. Priming ist wahrscheinlich ein serieller Prozess, bei dem gedockte Vesikel vom Depot-Pool in den slowly releasable pool (SRP) und dann in den rapidly releasable Pool (RRP) gelangen.

D. Zeitlich hochauflösende Experimente in Chromaffinzellen der Maus zeigen, dass CAPS bei der Umwandlung von SRP-Vesikeln zu RRP-Vesikeln eine Rolle spielt, da der RRP und der sustained Release im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollmäusen (wt) in  CAPS-Deletionsmutanten (dko) stark reduziert ist. Dieser Effekt kann durch Expression von CAPS1 wieder hergestellt werden (Rescue).

E. Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Chromaffinzelle der Maus. Pfeile zeigen Vesikel, die an der Membran andocken. Skalierung: 500 nm. 

Literaturangaben

Jahn R, Fasshauer D (2012). Molecular machines governing exocytosis of synaptic vesicles. Nature 490, 201-207.

Liu Y, Schirra C, Stevens DR, Matti U, Speidel D, Hof D, Bruns D, Brose N, Rettig J (2008). CAPS facilitates filling of the rapidly releasable pool of large dense-core vesicles. J Neurosci 28, 5594-5601.

Liu Y, Schirra C, Edelmann L, Matti U, Rhee J, Hof D, Bruns D, Brose N, Rieger H, Stevens DR, et al. (2010). Two distinct secretory vesicle-priming steps in adrenal chromaffin cells. J Cell Biol 190, 1067-1077.

Speidel D, Bruederle CE, Enk C, Voets T, Varoqueaux F, Reim K, Becherer U, Fornai F, Ruggieri S, Holighaus Y, et al. (2005). CAPS1 regulates catecholamine loading of large dense-core vesicles. Neuron 46, 75-88.

Stevens DR, Rettig J (2009). The Ca(2+)-dependent activator protein for secretion CAPS: do I dock or do I prime? Mol Neurobiol 39, 62-72.

Stevens DR, Wu ZX, Matti U, Junge, HJ, Schirra C, Becherer U, Wojcik SM, Brose N, Rettig J (2005). Identification of the minimal protein domain required for priming activity of Munc13-1. Curr Biol 15, 2243-2248.