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Ute Becherer:
Role of second messengers in the regulation of chromaffin cell secretion

Forschung

Unser wissenschaftliches Ziel ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen der regulierten Exozytose. Diese sind Grundlage der synaptischen Übertragung und der Freisetzung von Hormonen, wie z.B. Katecholaminen. Regulierte Exozytose ist ein mehrstufiger Prozess, der folgende Schritte beinhaltet:

  1. Mobilisierung aus dem Reserve-Pool
  2. Docking
  3. Priming
  4. Ca2+-abhängige Fusion

Eine Vielzahl von Proteinen und sekundärer Messenger vermittelt und kontrolliert diesen Prozess (s. Abb. 1 und Becherer & Rettig, 2006).

Im Fokus liegen die Exozytose von:

  • mit Katecholaminen befüllten, elektronendichten Granulen (engl. "large dense core vesicles", LDCVs) in Chromaffinzellen des Nebennierenmarks.
  • LDCVs und synaptischen Vesikeln (SVs) in Neuronen der Spinalganglien (engl.: "dorsal root ganglion", DRG)

Abbildung 1: Vesikel durchlaufen Docking und Priming Reaktionen, bevor sie nach Ca2+ Einstrom über CaV Kanäle mit der Plasmamembran fusionieren. Geprimte Vesikel sind über SNARE Komplexe (bestehend aus SNAP-25, Syntaxin1 und Synaptobrevin2) dicht an die Plasmamembran gebunden. Die Fusion der LDCVs mit der Plasma­membran wird durch Synaptotagmin getriggert. Docking der LDCVs benötigt Munc18, während Priming u.a. durch CAPS oder Munc13 reguliert wird.

Um unsere Fragestellungen zu beantworten, benutzen wir hauptsächlich die interne Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF-Mikroskopie) in Kombination mit Patch-Clamp Elektrophysiologie (Abb. 2 und Becherer et al. 2007). Diese Methode erlaubt die Visualisierung von Docking, Priming und Fusion einzelner, Fluoreszenz- markierter Vesikel in Echtzeit  (Film 1), während gleichzeitig die Membrankapazität gemessen und die Komposition des Intrazellulärmediums durch die Patch-Pipette kontrolliert wird. Diese Technik wird durch einen genetischen Ansatz (knock-out, rescue und gain of function Experimente) ergänzt.

Abbildung 2: Links: Experimenteller Aufbau für kombinierte TIRF-Mikroskopie und Patch-Clamp Elektro­physiologie.

Rechts: Beispiel eines solchen Experimentes. Oben ist die Membran­kapazitäts­veränderung dargestellt, die durch eine Serie von Depolarisationen eingeleitet wurde. Die TIRM-Bilder unten wurden am Anfang (1) und am Ende (2) des Experimentes aufgenommen. Sie zeigen die mit NPY-mRFP markierten, sezernierten Vesikel (gelbe Pfeile).

Mit dieser Methodik konnten wir zeigen, dass die Mobilität der LDCVs in Chromaffinzellen von ihrem funktionellen Stadium abhängt (Nofal et al., 2007). Desweiteren haben wir die Ca2+-Abhängigkeit des Docking-Prozesses in Chromaffinzellen untersucht und quantifiziert (Pasche et al., 2012). Schließlich konnten wir kürzlich eine neue Klasse von membrangebundenen Vehikeln identifizieren. Die so genannten dead-end Vesikel sind permanent an der Plasmamembran gedockt, ohne jemals Fusionskompetenz zu erreichen (Hugo et al., 2013).

Zurzeit identifizieren wir die molekulare Maschinerie, die dieses dead-end docking vermittelt. Schließlich wird die Art und die Modulierung der LDCV Freisetzung in DRG-Neuronen erforscht (Film 2).